Un nuovo metodo analitico consente di distinguere con maggiore accuratezza l’acido 3-idrossiglutarico dall’acido 2-idrossiglutarico, migliorando la conferma diagnostica
Uno studio canadese pubblicato su JIMD Reports descrive lo sviluppo e la validazione di un nuovo metodo diagnostico per l’aciduria glutarica di tipo 1 (GA1), una rara malattia metabolica ereditaria inclusa nei pannelli di screening neonatale in molti Paesi, inclusa l’Italia. Il gruppo di ricerca dell’Università di Sherbrooke (Quebec, Canada), coordinato da Denis Cyr e Paula J. Waters, ha messo a punto un saggio basato sulla gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa tandem (GC–MS/MS), in grado di quantificare separatamente l’acido 3-idrossiglutarico (3-HG) e l’acido 2-idrossiglutarico (2-HG) nelle urine, superando i limiti analitici dei metodi GC–MS tradizionali.
LO SCREENING PER L’ACIDURIA GLUTARICA DI TIPO 1
L’aciduria glutarica di tipo 1 (GA1) fa parte delle acidurie organiche: è un disordine autosomico recessivo del metabolismo della lisina, causato da varianti patogenetiche nel gene GCDH, che codifica per la glutaril-CoA deidrogenasi. La perdita di attività enzimatica determina l’accumulo di acido glutarico (GA), acido 3-idrossiglutarico (3-HG), acido glutaconico e glutarilcarnitina nei fluidi corporei.
La malattia ha una prevalenza mondiale stimata di 1 caso su 100.000 nati e, se non trattata, può causare un grave deterioramento neurologico nella prima infanzia, in particolare a carico dei gangli della base. Tuttavia, la GA1 è una malattia trattabile: una diagnosi precoce attraverso lo screening neonatale, associata a una terapia dietetica (restrizione degli aminoacidi precursori del glutaril-CoA) e supplementazione di L-carnitina, può ridurre significativamente il rischio di complicanze neurologiche irreversibili.
Molti Paesi, tra cui l’Italia, hanno incluso GA1 nei pannelli di screening neonatale esteso tramite l’analisi delle acilcarnitine su spot di sangue essiccato (DBS) mediante spettrometria di massa tandem (MS/MS). Un risultato positivo allo screening richiede indagini biochimiche di conferma, tra cui tipicamente l’analisi del profilo degli acidi organici urinari e la quantificazione di acido glutarico e acido 3-idrossiglutarico.
IL PROBLEMA ANALITICO
L’acido 3-idrossiglutarico è considerato il principale neurotossina nella GA1, ed è il biomarcatore più affidabile per la diagnosi, in particolare nei cosiddetti “low excretors”: infatti, una quota significativa di pazienti con GA1 che presentano livelli urinari di acido glutarico normali o solo lievemente elevati, ma che rimangono comunque ad alto rischio di malattia neurologica severa. In questi soggetti, solo il dosaggio preciso del 3-HG può orientare correttamente la diagnosi.
Il problema è che il 3‑HG è molto simile, per struttura e comportamento analitico, al 2‑idrossiglutarico (2‑HG). Le due molecole hanno la stessa formula chimica ma una disposizione diversa degli atomi, e nei metodi GC–MS tradizionali vengono rilevate nello stesso momento, rendendo difficile la quantificazione accurata del 3-HG quando è solo lievemente presente. L’acido 2-HG, a sua volta, è un marcatore di altri disordini neurometabolici (le 2-idrossiglutaricoacidurie e la deficienza multipla di acil-CoA deidrogenasi), ed è fondamentale saperlo distinguere correttamente dal 3-HG per evitare diagnosi errate.
LA SOLUZIONE E I VANTAGGI
Il gruppo di Sherbrooke ha sviluppato un metodo GC–MS/MS che sfrutta la spettrometria di massa tandem in modalità Multiple Reaction Monitoring (MRM), che permette di separare e misurare in modo selettivo i segnali del 3‑HG e del 2‑HG, eliminando quasi del tutto le interferenze che nei metodi tradizionali impediscono di distinguerli anche quando escono dalla colonna nello stesso momento.
La validazione del metodo è stata condotta secondo i criteri ISO 15189 e le linee guida COFRAC. I risultati mostrano performance soddisfacenti in termini di precisione e accuratezza. Il laboratorio di Sherbrooke lo utilizza in routine da oltre un anno, come test di conferma per i neonati positivi allo screening neonatale nelle province canadesi afferenti al centro, e come strumento diagnostico per pazienti con sospetto clinico di GA1.
Questo lavoro ha una rilevanza diretta per i laboratori impegnati nella conferma biochimica dei casi positivi allo screening neonatale per GA1. La sfida diagnostica dei “low excretors” – soggetti che possono avere acido glutarico normale, ma acido 3-idrossiglutarico isolatamente elevato – richiede metodi analitici con elevata sensibilità e specificità per il 3-HG. La mancata separazione cromatrografica con il 2-HG nei metodi GC–MS standard può portare a falsi negativi o a risultati ambigui proprio in questi casi critici.
La tecnologia GC–MS/MS non è ancora diffusa in tutti i laboratori di biochimica clinica, ma il suo utilizzo è in crescita. I risultati di questo studio offrono un esempio concreto dei vantaggi che la spettrometria di massa tandem può apportare alla diagnostica genetico-metabolica, in termini di selettività analitica, affidabilità dei risultati e ottimizzazione del flusso di lavoro di laboratorio.
